E' un museo di Milano fondato da Federico Borromeo nel 1618 nei pressi della Biblioteca Ambrosiana.
La struttura nacque nei pressi della Biblioteca Ambrosiana per assicurare una formazione culturale gratuita a chiunque avesse qualità artistiche o intellettuali. Alla Pinacoteca fu infatti affiancata, fin dal 1621, un'accademia di pittura e scultura, con calchi in gesso del Laocoonte e della Pietà di Michelangelo provenienti dalla raccolta di Leone Leoni. Il primo docente di pittura fu il Cerano; unico allievo di una certa importanza fu Daniele Crespi. Una "Seconda Accademia Ambrosiana", riformata in senso classicista su impulso del pittore Antonio Busca e dallo scultore Dionigi Bussola, fu attiva tra il 1668 e la fine del Settecento.
La Biblioteca e la Pinacoteca Ambrosiana sono strettamente collegate, anche la prima raccoglieva una serie di dipinti con dotti e sapienti del mondo classico e della cultura cristiana e conteneva al suo interno disegni e codici miniati: nel 1637 furono donati da Galeazzo Arconati i manoscritti di Leonardo oggi all'Institut de France. Un altro tesoro della Biblioteca è il manoscritto con l'opera di Virgilio già appartenuto a Petrarca con una miniatura di Simone Martini.
Nella Pinacoteca si possono trovare oggi opere, provenienti dalla collezione di Federico Borromeo, nei quattro corridoi che circondano la sala di lettura della Biblioteca, e da numerosi lasciti successivi, tra cui dipinti di Leonardo, Botticelli, Bramantino, Bergognone, Bernardino Luini, Tiziano, Jacopo Bassano, Moretto, Caravaggio, Morazzone, Daniele Crespi, Andrea Appiani, Francesco Hayez. Interessante dal punto di vista storico è la produzione di copie da dipinti celebri, promossa da Federico Borromeo per scopi didattici e documentativi, come la replica dell'Ultima Cena di Leonardo, che già nel XVII secolo era in condizioni assai precarie.